Espectroscopia IR y espectroscopia FTIR: cómo funciona un espectrómetro FTIR y análisis FTIR

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La espectroscopía infrarroja por transformada de Fourier (FTIR) es una técnica muy popular en la actualidad debido a su combinación única de sensibilidad, flexibilidad, especificidad y robustez. Capaz de hacer frente a analitos sólidos, líquidos y gaseosos, se ha convertido en una de las técnicas instrumentales analíticas más practicadas en la ciencia. Aunque existen una serie de limitaciones conocidas para FTIR, como su relativa intolerancia al agua y su sensibilidad a las propiedades físicas de la matriz de análisis, es, sin embargo, muy popular y comúnmente utilizado en industrias tan diversas como la de alimentos y bebidas1. química, ingeniería, ambiental2, farmacéutica3 y biomasa4 y en entornos clínicos.5 Las formas de instrumentación adecuadas ahora incluyen dispositivos de mesa, portátiles y en línea en tiempo real.

¿Qué es la espectroscopia IR?

¿Qué es la espectroscopia FTIR y cuál es la diferencia entre la espectroscopia FTIR y la espectroscopia IR?

¿Cómo funciona FTIR?

Análisis FTIR y recopilación de datos FTIR

Cómo interpretar un espectro IR y un espectro FTIR. Gráfico de espectro IR

Ventajas, desventajas y usos de la espectroscopia IR/FTIR media y cercana

Aplicaciones FTIR: presente y futuro

El ojo humano sólo puede ver una pequeña parte del espectro mucho más amplio de radiación electromagnética (Figura 1). En el lado de alta energía del espectro visible se encuentra la región ultravioleta (UV), mientras que en el lado de menor energía está el infrarrojo (IR). Las regiones IR más útiles para el análisis de compuestos orgánicos tienden a tener una longitud de onda de 2.500 a 16.000 nm. El IR lejano, medio y cercano (NIR) se incluyen bajo el paraguas de “espectroscopia molecular”.

La espectroscopia IR es el estudio de la interacción de la luz IR con la materia, donde la luz IR se caracteriza por un rango de número de onda que abarca de 12.800 a 10 cm-1. Históricamente, por convención, la IR tiende a describirse en “número de onda”, donde cualquier número de onda es inversamente proporcional a su longitud de onda. Por lo tanto, una longitud de onda más corta tendrá un número de onda mayor, en referencia a que más ondas podrían caber en una distancia determinada. El IR lejano se define típicamente como radiación entre 500 y 20 cm-1, el IR medio entre 4000 y 500 cm-1 y el NIR típicamente entre ~ 10 000 y 4000 cm-1.

La luz IR es absorbida por moléculas a frecuencias específicas según los enlaces moleculares entre los átomos y los tipos de átomos presentes al final de los enlaces. Las energías de los fotones en la región IR inducen la excitación vibratoria de átomos unidos covalentemente. A menudo se considera que estos enlaces covalentes actúan como resortes rígidos que pueden estirarse, doblarse, girarse y moverse (Figura 2). La radiación IR media de mayor energía excita vibraciones fundamentales cuando las moléculas absorben energía, elevándolas del estado fundamental al primer estado vibratorio. Por el contrario, la espectroscopia NIR se compone de bandas combinadas de "armónicos" producidos a partir de esas vibraciones fundamentales. También se dirige al lector al material introductorio adicional útil disponible en la Royal Society of Chemistry.

Figura 2: Animación que muestra los movimientos tridimensionales que pueden ocurrir en los enlaces atómicos moleculares cuando se excitan con luz IR. Estos movimientos provocan las bandas de absorbancia espectral IR que observamos. Crédito: Tomado de YouTube https://www.youtube.com/watch?v=0S_bt3JI150

La diferencia entre IR y FTIR es que este último se construye a partir de un interferograma como señal sin procesar. Esto representa la intensidad de la luz en función de la posición de un espejo dentro del interferómetro, no en función de la longitud de onda (como ocurre en los instrumentos dispersivos). Este es el "FT". La señal primero debe someterse a una transformada de Fourier (FT) para producir la intensidad en función del número de onda.

Por convención, cuando hablamos de FTIR, pensamos que opera en la región del IR medio. Sin embargo, la instrumentación FT está disponible para formas espectrales UV y NIR. FTIR y FT-NIR son técnicas potencialmente complementarias, pero normalmente el analista debe elegir cuál utilizar para una aplicación particular, por lo que vale la pena considerar sus fortalezas y debilidades relativas.

La adquisición de espectros FTIR es mucho más rápida que con los instrumentos dispersivos convencionales. El método FT produce espectros que muestran una relación señal-ruido mucho mejor y, como la escala de longitud de onda está calibrada con un láser de referencia muy preciso, proporciona una mayor precisión de longitud de onda que el IR.

Los espectrofotómetros infrarrojos se desarrollaron a mediados de la década de 1940. Inicialmente, sus aplicaciones se limitaron principalmente a trabajos de investigación sobre compuestos orgánicos, y principalmente en el campo petroquímico. Estos primeros instrumentos fueron espectrofotómetros de barrido dispersivo (Figura 3) y lentos. Los instrumentos dispersivos todavía existen y han encontrado una nueva vida en aplicaciones novedosas, ya que pueden miniaturizarse más fácilmente y fabricarse de manera mucho más económica, para producir paquetes pequeños, de bolsillo, con sistemas operativos simples que se ejecutan en teléfonos móviles.

Hoy en día, la mayoría de los instrumentos de infrarrojo medio de grado de investigación y desarrollo son del tipo FT. Su desarrollo se remonta a la década de 1890 y al trabajo de Albert Michelson, quien, mientras estudiaba la velocidad de la luz, inventó el "interferómetro", por el que recibió el Premio Nobel. Un instrumento FTIR utiliza un interferómetro (Figura 4), que consta de una fuente, un divisor de haz, dos espejos, un láser y un detector. La energía va desde la fuente al divisor del haz, que divide el haz en dos partes. Una parte se transmite a un espejo en movimiento y la otra se refleja a un espejo fijo. El espejo móvil se mueve hacia adelante y hacia atrás a una velocidad constante, controlada por la respuesta del láser de calibración. Los dos haces se reflejan en los espejos y se recombinan nuevamente en el divisor de haz, generando un patrón de interferencia, que se transmite a través del compartimento de la muestra (y, si está presente, la muestra donde se produce la absorbancia) al detector. Luego, esta señal se somete a la función FT para generar un espectro.

La forma de onda de interferencia resultante, llamada "interferograma", (que se analiza más adelante) producida por el instrumento FT codifica toda la información en todas las longitudes de onda medidas. Sin embargo, para generar un espectro interpretable, la señal primero debe someterse a una función matemática de transformada de Fourier computacionalmente intensiva. En 1966, el desarrollo del algoritmo de Coey-Tukey6, 7 proporcionó un cálculo abreviado, la “transformada rápida de Fourier” o FFT. Esto, junto con la llegada de los primeros sistemas informáticos comerciales, permitió el lanzamiento del primer FTIR comercial, el FTS-14, en 19698 (Figura 5).

El análisis utilizando un FTIR se realiza de la siguiente manera.

En la actualidad existe toda una gama de instrumentos FTIR y accesorios intercambiables versátiles que permiten analizar muestras gaseosas, líquidas y sólidas de diferentes tamaños y formas con el mismo instrumento básico. Vale la pena señalar que el vidrio normal no es transmisible en el IR medio, por lo que todas las ópticas del instrumento y los accesorios de muestreo deben construirse con otros materiales ópticos IR adecuados. Las primeras técnicas desarrolladas para muestras sólidas requerían que el analito se moliera y se mezclara con sustratos transmisibles por infrarrojos, a menudo bromuro de potasio (KBr), a alta presión en un pequeño disco sólido transparente. Luego se montaron en un soporte para realizar mediciones de transmisión. Las muestras líquidas (que no contienen agua) a menudo se formaban como películas delgadas entre dos discos transmisibles por IR con un pequeño espaciador. El tiempo y la reproducibilidad fueron problemas con este método.

En los últimos 30 años, ha habido una creciente adopción de alternativas, en particular las ahora omnipresentes técnicas de “ATR” (reflectancia total atenuada). Este dispositivo puede acomodar pequeñas cantidades de muestra líquida o sólida colocada en una ventana de cristal sin necesidad de una preparación real de la muestra, lo que permite recolectar un espectro en unos pocos segundos. Cuando se analizan los sólidos, se presionan firmemente sobre la ventana de cristal mediante una abrazadera de fijación superior (Figura 6). La mayoría de las aplicaciones publicadas para muestras sólidas utilizan ahora esta forma de dispositivo. Otros tipos de dispositivos, como un hemisferio reflectante para reflectancia difusa o celdas selladas para muestras de gas, también están disponibles para aplicaciones específicas. Incluso hay placas con formato de microtitulación de 96 posiciones fabricadas con oro y otros materiales compatibles con IR, lo que permite una detección de alto rendimiento utilizando unidades accesorias FTIR especialmente adaptadas.9

Un modo de operación típico (Figura 7) requiere primero que se recopile un espectro de fondo "en blanco". Este contendrá valores de absorbancia de toda la trayectoria del haz de luz (óptica y atmosférica). Luego se analiza la muestra y se le resta el espectro en blanco para obtener las respuestas espectrales exclusivas de la muestra sola. Tanto la resolución del número de onda (normalmente de 4 a 16 cm-1) como los escaneos coagregados (normalmente de 8 a 64) requieren una optimización específica de la aplicación para lograr un equilibrio aceptable entre señal y ruido. Los escaneos individuales son rápidos, normalmente menos de 1 segundo en los instrumentos modernos, por lo que con la suma conjunta de escaneos y la sustracción espectral de fondo, los flujos de trabajo de análisis para una sola muestra en un dispositivo ATR se pueden lograr en menos de 2 minutos. Esto hace que FTIR-ATR sea particularmente ideal para medir cientos o miles de muestras en aplicaciones de fabricación o detección, incluida la toma de huellas dactilares metabolómicas.10

Los espectros FTIR son ricos en información, pero este mismo hecho puede dificultar su uso e interpretación. Puede encontrar una introducción útil para interpretar FTIR aquí. Incluso una muestra simple, pura y de un solo compuesto, como la vainillina (Figura 8), tiene un espectro de múltiples picos. En tales casos, los enfoques de comparación de bibliotecas con un estándar autenticado pueden identificarlo en una mezcla de un solo componente, pero esto sería imposible en mezclas complejas de otros compuestos. El problema es que la mayoría de los compuestos orgánicos contienen combinaciones de átomos de carbono (C), hidrógeno (H), nitrógeno (N) u oxígeno (O) en enlaces simples o dobles, por lo que los mismos picos de absorción múltiples se superponen de un compuesto a otro. Simplemente tratar de “observar” muchos espectros para intentar juzgar si las muestras de las que provienen son diferentes de alguna manera, o cómo, rápidamente se convierte en un desafío abrumador, incluso para un analista experimentado. Para abordar este problema, los datos FTIR se utilizan frecuentemente en combinación con enfoques de modelado estadístico, como el análisis multivariado (MVA), que en el contexto de la química comúnmente se denomina "quimiometría".

Los datos espectrales FTIR son muy adaptables a las técnicas MVA, que en esencia simplemente necesitan recolectar múltiples espectros de cada muestra y construirlos en una única matriz de datos. Aquí, cada fila de la tabla es el espectro completo de una muestra individual y cada columna es la absorbancia alineada para números de onda consecutivos particulares en todas las muestras. De esta forma, se pueden aplicar técnicas como el análisis de componentes principales (PCA) para explorar y visualizar posibles relaciones basadas en clases entre las respuestas espectrales de diferentes grupos de muestras de manera eficiente a través de sus gráficos de puntuaciones. Esto proporciona una "interpretabilidad" inmediata de las diferencias de las muestras, que es muy difícil de medir simplemente superponiendo espectros de diferentes clases de muestras. En la Figura 9 se muestra un ejemplo de un gráfico de puntuaciones de PCA para las diferenciaciones de muestras de bioaceite crudo versus procesado.

Cuando el objetivo es la cuantificación (por ejemplo, valores de concentración), los enfoques MVA, como la regresión de mínimos cuadrados parciales, se pueden utilizar para construir predicciones de calibración basadas en valores cuantitativos para propiedades como concentraciones químicas, utilizando datos previamente recopilados sobre la composición de cada muestra de otras técnicas de ensayo. Estos valores conocidos luego se introducen en el cálculo algorítmico para identificar las características espectrales que mejor se correlacionan con el valor externo de interés. Este último enfoque es muy popular ya que, cuando se planifica y valida adecuadamente, puede permitir que FTIR reemplace eficazmente los ensayos de química húmeda para nuevas muestras desconocidas (del mismo tipo), ahorrando tiempo y dinero. Una consecuencia útil de la construcción de modelos MVA es que la tabla de resultados estadísticos producida, además de los gráficos de muestra, permite identificar la longitud de onda más importante utilizada en la construcción del modelo. A partir de esta información a menudo es posible interpretar algunos conocimientos químicos directos.

Prácticamente siempre se supone que FTIR es FTIR "medio". Los instrumentos dispersivos de IR medio que no son FT no pueden producir este amplio espectro ya que la velocidad de escaneo es lenta y su potencia (señal-ruido) es mucho más pobre. Sin embargo, NIR tiene tanta más energía que un instrumento dispersivo que no sea FT puede producir espectros similares a los instrumentos FTIR medios. Pero llevaría más tiempo y, por lo tanto, la resolución (número de números de onda reales medidos) tiende a ser menor.

El siguiente cuadro (Figura 10) muestra las bandas producidas por los principales grupos funcionales (1500 cm-1 y superiores). La región 500-1500 cm-1, que se encuentra en la región del IR medio, se denomina región de huellas dactilares y proporciona huellas dactilares moleculares exclusivas de compuestos específicos que no se pueden falsificar.

La forma y estructura de los espectros de IR medio y NIR son bastante diferentes, ya que los espectros de IR medio contienen bandas de absorción espectral más nítidas y definidas (Figura 11) para especies orgánicas, lo que presta la técnica a la elucidación estructural y la identificación de compuestos. Además, a lo largo de los años se han recopilado y publicado tablas de datos detalladas de regiones de números de onda de grupos de funciones moleculares características, muchas de ellas dentro de áreas de aplicación específicas. Las moléculas orgánicas absorben fuertemente la radiación IR media, por lo que se pueden obtener buenos espectros a partir de relativamente poco material de muestra (p. ej., unos pocos granos de polvo). Las desventajas incluyen su intolerancia al agua (que apaga la señal IR incluso cuando está presente en solo un pequeño porcentaje). Además, el hecho mismo de que los compuestos orgánicos generalmente absorban tan bien el IR medio significa que el espectro resultante solo será de unas pocas micras de penetración de la muestra y representará una homogeneidad limitada. Por lo tanto, se necesita una preparación de muestras o una replicación analítica considerablemente más cuidadosa.

Las ventajas de NIR incluyen una fuerte respuesta a los atributos químicos y físicos de la muestra (por ejemplo, lo que lo hace útil para aplicaciones generales de clasificación de muestras). La radiación NIR logra una penetración mucho mayor en la muestra, ya que solo se absorbe débilmente, por lo que un mayor volumen de muestreo puede aumentar la sensibilidad, obtener una mejor homogeneidad y requerir mucha menos preparación de la muestra para realizar una medición. Las principales desventajas de NIR están asociadas con la especificidad química. La mayoría de las respuestas moleculares NIR son sobretonos de primer orden (o superior), que exhiben grados de superposición de señales, lo que potencialmente limita el poder discriminatorio. Sin embargo, lo que se considera ventaja versus desventaja es completamente específico de la aplicación, por lo que tanto los instrumentos de IR medio como los de NIR se utilizan ampliamente para diferentes aplicaciones.

FTIR se encuentra en un “punto óptimo” bastante singular en términos de costos de equipo, facilidad de uso y la información que puede producir. Su flexibilidad ha hecho que se aplique a más áreas de las que hay espacio para discutir en este artículo. Una variedad de aplicaciones farmacéuticas y médicas son cada vez más comunes.11

Además, un desarrollo técnico particularmente interesante en los últimos 20 años ha sido la aparición y evolución de las imágenes químicas basadas en chips de vídeo FTIR (focal place array, “FPA”) para uso en microscopía. Si bien los microscopios FTIR existen desde la década de 1970 en formato estándar, solo usan un detector IR de un solo punto, y cualquier imagen solo se puede lograr uniendo grandes cantidades de mediciones espaciales individuales. Se necesitarían horas para recopilar tales imágenes, incluso de algo pequeño como un trozo de tejido cortado de un cm-2. Los chips modernos de imágenes de infrarrojo medio, como los conjuntos de tamaño típico de 128 x 128 píxeles (pero que pueden tener una resolución más alta), ahora se han convertido en estándar. Una matriz de 128x128 produce 16.000 espectros resueltos espacialmente en un escaneo. Las imágenes se pueden adquirir en menos de 30 a 60 segundos y se han utilizado ampliamente. Esto hace posible aplicaciones resueltas espacialmente como ciencias forenses, artefactos arqueológicos, contaminantes físicos como microplásticos, pruebas de tabletas prensadas farmacéuticas12 y detección de biopsias de tejido para detectar el estado de la enfermedad y la predicción diagnóstica. 13, 14 FTIR-FPA puede aplicarse útilmente a situaciones en las que las señales químicas deben interpretarse dentro de un contexto espacial amplio.15, 16

Referencias

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2. Freitag S, Thain SC, Squier AH, Hogan EJ, Crittenden PD. Evaluación de los cambios metabólicos del liquen de reno C. portentosa para aumentar los aportes ambientales de N mediante técnicas de elaboración de perfiles y huellas dactilares metabolómicas. comp. Bioquímica. Fisiol. 2009;153(2, Suplemento):S57. doi:10.1016/j.cbpa.2009.04.518

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10. Ribeiro da Cunha B, Fonseca LP, Calado CRC. Huellas dactilares metabólicas con espectroscopía infrarroja por transformada de Fourier (FTIR): hacia un ensayo de detección de alto rendimiento para el descubrimiento de antibióticos y la elucidación del mecanismo de acción. Metabolitos. 2020;10(4):145. doi:10.3390/metabo10040145

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